Arquitectura Nuclear

Nuestra trabajo de investigación se focaliza en el estudio de la interrelación entre factores de transcripción y factores nucleares que regulan la organización de la cromatina durante procesos de diferenciación celular tales como adipogénesis, miogénesis y neurogénesis.

 

Our research work is focused in the study of the interrelation between nuclear proteins and transcription factors that regulate the organization of the chromatin and gene expression, events that control the processes of cell differentiation such us adipogenesis, myogenesis and neurogenesis. 

Arquitectura Nuclear

  • Directora

    Dra. Graciela Piwien-Pilipuk Currículum Vitae

    Bioquímica, egresada de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires.

    PhD (2001) Facultad de Farmacia y Bioquímica - UBA, Argentina – The University of Michigan Medical School, USA.

    Investigadora Adjunta de CONICET.

  • Integrantes

    Dr. Sebastián Susperreguy, Investigador Asistente –CONICET

    Dra. Judit Toneatto, becaria postdoctoral- CONICET

    Bioq. Nancy Charó, becaria doctoral –CONICET

    Lic. Ana Laura Reyes, miembro de la carrera de Maestría y Doctorado de la Universidad de la República, Facultad de Ciencias, Montevideo, Uruguay.Concurrente en el marco de un trabajo en colaboración con el Dr. G. Follé, su director de tesis, y director del Departamento de Genética del Instituto Clemente Estable de Montevideo, Uruguay.

Línea de investigación

La secuenciación del genoma humano ha marcado, indudablemente, el inicio de una nueva era en el campo de la biología. Sin embargo, la simple información de cómo se organizan los genes en los distintos cromosomas no es suficiente para entender, por ejemplo, en qué tipo celular, bajo qué tipo de estímulo y cuán frecuentemente un gen será transcripto. Si bien sabemos que complejos multimoleculares conformados por factores de transcripción, co-activadores y los componentes de la maquinaria basal controlan la transcripción de los genes, tanto la eficiencia como la precisión del proceso transcripcional dependen también de la organización de la arquitectura nuclear. Ello se debe a que el genoma se encuentra espacialmente organizado. Los cromosomas en interfase ocupan un espacio discreto en el núcleo denominado territorio cromosómico. Dichos territorios están surcados por canales intercromosómicos que permiten el acceso de los factores necesarios para regular la transcripción. Se ha demostrado a través del marcado de RNA nasciente con Br-UTP que la transcripción ocurre tanto en la superficie como en el interior de los territorios. Además el núcleo se encuentra organizado en distintos compartimentos los cuales, a diferencia de los compartimentos citoplasmáticos, no se encuentran delimitados por membranas y su ensamblado-desensamblado es altamente dinámico. Dentro del listado de compartimentos nucleares el más conocido es el nucléolo, pero en dicha lista debemos incluir a los cuerpos de Cajal, los cuerpos PML (Promielocitic leukemia), los speckles o gránulos intercromatínicos formados por diversas proteínas que participan en el splicing de los ARNm, los paraspeckles también gránulos intercromatínicos formados por factores que participan en la regulación de la transcripción y del almacenamiento de ARNm en el núcleo, para citar algunos ejemplos. La organización del núcleo se relaciona tanto con el mantenimiento de la integridad del genoma como con el control de la expresión génica influyendo así en procesos de proliferación, diferenciación celular, en respuesta a estímulos hormonales o a estrés. La importancia funcional de la compartimentalización nuclear queda demostrada por el hecho que alteraciones en la organización nuclear se observan en patologías, por ejemplo hay ausencia de los cuerpos PML en la leucemia mieloide aguda promielocítica.  La diferenciación celular implica el mantenimiento de un conjunto de genes en condiciones de ser expresados mientras que el resto es silenciado. Este evento recíproco de activación y silenciamiento de genes durante la diferenciación celular es un punto crítico en la organogénesis. Pero, ¿cómo se integra la regulación de la expresión de genes durante el proceso de diferenciación celular en el contexto de la arquitectura nuclear? Aún no se cuenta con respuestas concretas a esta pregunta. Es por ello que investigar los mecanismos que definen la organización del núcleo es fundamental para entender cómo una célula indiferenciada, por ejemplo una célula madre, una célula mesenquimal, un preadipocito o un mioblasto delinean la arquitectura de su núcleo a medida que se diferencian hasta adoptar el fenotipo final. En este escenario, la expresión de genes durante el proceso de diferenciación celular estaría afectada por una regulación espacio-temporal dependiente de una precisa organización subnuclear y/o localización de factores que facilitarían y/o controlarían el ensamblado de complejos regulatorios multimoleculares formado tanto por factores involucrados en transcripción como factores que modulan la estructura de la cromatina. Es por ello que en nuestro laboratorio, estudiamos la dinámica nuclear y la interrelación de los factores de transcripción CAAT-Enhancer Binding Protein (C/EBP) y HP (heterochromatin Protein)1, proteínas nucleares no histónicas que participan en la organización de la estructura de la cromatina.

Los C/EBPs pertenecen a la familia de factores de transcripción bZIP, la cual incluye a C/EBPα, C/EBPβ, C/EBPδ, C/EBPγ, C/EBPε y C/EBPζ. C/EBPβ juega un rol fundamental durante la diferenciación de diversos tipos celulares tales como adipocitos, hepatocitos, el desarrollo de la glándula mamaria y en la diferenciación mielomonocítica. En particular, C/EBPβ es también un importante factor regulador de numerosos genes hepáticos, tales como los que codifican para las proteínas de fase aguda cuya expresión se incrementa en respuesta a la infección-inflamación, así como también en la regulación de genes involucrados en la regulación del metabolismo de los hidratos de carbono. Debido a que la regulación del metabolismo, proliferación y diferenciación celular implica una estricta y coordinada regulación en la expresión de determinado grupo de genes, la participación de C/EBPβ en una gama tan amplia de procesos sugiere una gran plasticidad del mismo para mediar procesos biológicos tan diversos.  C/EBPβ posee productos alternativos de traducción a partir del mismo ARNm (Fig.1): las isoformas de C/EBPβ de 35-kDa y 32-kDa o LAP (Liver Activating Protein), activan la transcripción. En contraposición, la isoforma de 20-kDa o LIP (Liver Inhibitory Protein) carece de la mayor parte del dominio N-terminal de transactivación, y por lo tanto actúa inhibiendo la transcripción.  LAP y LIP forman tanto homo- como heterodímeros. Hemos descripto que C/EBPβ regula la expresión del proto-oncogen c-fos mediada por hormona de crecimiento (GH). Empleando inmunofluorescencia indirecta (IFI) y microscopía confocal demostramos que GH promueve la relocalización de C/EBPβ a regiones de heterocromatina pericentromérica, evento dependiente de la activación de la vía de las MAPK-ERK1/2. La misma distribución nuclear se observa cuando se induce la diferenciación adipocítica de los fibroblastos 3T3-L1. Pero la IFI tiene limitaciones que impiden determinar la precisa distribución subnuclear de los homodímeros y heterodímeros de C/EBPβ, ya que los anticuerpos identifican tanto a LAP como LIP. Por este motivo recurrimos al análisis por BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) empleando microscopía confocal en células vivas. Como se puede observar en el esquema de la figura 2, si a las proteínas en estudio se le fusiona un fragmento amino terminal o carboxilo terminal de la YFP, las proteínas de fusión por sí mismas no fluorescen. En cambio, si ellas interactúan, la proximidad de los fragmentos YN e YC permite el re-ensamblado de la YFP recuperándose la fluorescencia, evento que prueba la interacción proteína-proteína. Además, el ensayo de BiFC tiene la ventaja de que el “tubo de ensayo” es la célula permitiendo averiguar el compartimiento subcelular donde la interacción tiene lugar. Empleando esta estrategia experimental pudimos demostrar que mientras los homodímeros de LAP se localizan tanto en eucromatina como en heterocromatina pericentromérica (Fig. 3, panel A), los homodímeros de LIP se localizan exclusivamente en heterocromatina pericentromérica (Fig 3, panel B), y los heterodímeros LAP-LIP se ubican tanto en regiones tanto eucromáticas como heterocromáticas (Fig 3, panel C). Esta localización diferencial de los distintos dímeros de C/EBPβ es importante para la regulación de la biodisponibilidad de los mismos. LAP, es un activador de la transcripción y por lo tanto se encuentra en regiones de eucromatina favorables para la expresión de los genes blanco. En cambio LIP es un inhibidor de la transcripción y se concentra en heterocromatina pericentromérica, compartimiento con bajo número de genes a ser transcriptos y baja tasa de transcripción, posiblemente cumpliendo una función represora.  Pero nosotros estamos interesados en saber cómo se coordina la transcripción en el marco de la organización de la cromatina. Encontramos que C/EBPβ co-localiza con la proteína no histónica HP1α. Como co-localización no es sinónimo de interacción, investigamos si LAP y/o LIP interactuaban con HP1α encontrando que las dos formas de C/EBPβ eran capaces de hacerlo. De manera relevante, demostramos mediante BiFC que los dominios nucleares donde tiene lugar la interacción entre estos factores coinciden con los dominios nucleares donde se localizan los distintos dímeros.

La pregunta que surge es ¿cuál es la importancia funcional de la interacción entre C/EBPβ, un factor de transcripción, y HP1α un modulador de la estructura de la cromatina? Para tratar de contestar a esta pregunta debemos hacer una breve reseña sobre HP1α. La cromatina puede encontrase como eucromatina (cromatina laxa) o heterocromatina (cromatina condensada). El grado de compactación de la cromatina se debe en parte a modificaciones epigenéticas en las colas de las histonas que sirven de anclaje a proteínas que estabilizan dichas estructuras. Tal es el caso de la trimetilación de en la lisina 9 de la histona H3 (3MeK9H3) que sirve para reclutar a HP1α, modificación epigenética presente en heterocromatina. Hp-1α interactúa con la metiltranferasa responsable de la 3MeK9H3 lo que ayuda a estabilizar la estructura compacta y a propagar la heterocromatinización. C/EBPβ se encuentra constitutivamente unido a sus genes blanco como c-fos o c/ebpα, sin embargo la expresión de estos genes se encuentra perfectamente regulada.  Empleando ChIP pudimos demostrar que en preadipocitos 3T3-L1, HP1α y C/EBPβ se encuentran presentes en el promotor de dichos genes cuando los mismos no se expresan.  Al inducir la diferenciación de los preadipocitos HP1α a abandona el promotor de c/ebpα, coincidente con el aumento de la expresión de dicho gen requerida para que la adipogenesis tenga lugar.  En cambio HP1α persiste unido al promotor de c-fos, gen cuya expresión no se induce cuando los preadipocitos se diferencian.  Estos resultados sugieren que C/EBPβ puede facilitar el reclutamiento de HP1α al promotor del gen blanco, induciendo la “heterocromatinización” local de gen. Cuando la señal apropiada llega y se induce la diferenciación de los preadipocitos, se pierde la interacción entre C/EBPβ y HP1α, este último abandona el promotor y se activa la transcripción. También es posible que el complejo C/EBPβ- HP1α modulen el reclutamiento de genes a dominios nucleares poco permisivos para la transcripción como las regiones de heterocromatina pericentromérica y entonces en lugar de activarse el gen se silencie, posibilidad que nos encontramos investigando.  También estamos estudiando la dinámica nuclear y el rol de otro miembro de la familia de las HP1, la isoforma gama. Hp1γ, a diferencia de HP1α, tiene una distribución principalmente eucromática y se la ha descripto asociada a la RNA Polimerasa II activa. Estamos analizando la posibilidad que Hp1γ reemplace a HP1α en aquellos genes que deban ser transcriptos.

Por último, y no por ello menos importante, nos interesa investigar las señales responsables de estos eventos nucleares. Sabemos que tanto los glucocorticoides como los mineralocorticoides son estímulos hormonales importantes en la inducción de la diferenciación adipocítica. Estas hormonas ejercen su acción a través de su unión a sus receptores que son factores de transcripción integrantes de la familia de los receptores nucleares (RN). Para poder unir hormona tanto el receptor de glucocorticoides (GR) como el de ALDO (MR) debe estar unido a un dímero de hsp90. El dímero de hsp90 forma un sitio aceptor que reconoce al dominio TPR (Tetratricopeptide Repeat) de las inmunofilinas (IMMs) de alto peso molecular. Las inmunofilinas constituyen una familia de proteínas que reciben su nombre por su capacidad de unir a las drogas inmunosupresoras rapamicina, ciclosporina-A o FK506 (subfamilia FKBP, por FK506-Binding Protein). Las IMMs asociadas a la inmunosupresión son las de bajo peso molecular mientras que la función de las de alto peso molecular no está aún bien definida más allá de lo descripto para los receptores nucleares. En el modelo de señalización que surge del trabajo en colaboración con el grupo que dirige el Dr. Galigniana, la unión de la hormona a GR o a MR produce un intercambio de IMMs en donde FKBP51 es reemplazada de su unión con hsp90 por FKBP52, IMM con capacidad para interaccionar con componentes de la maquinaria motora facilitándose así el movimiento retrógrado de GR y de MR, y la interacción de los complejos con el poro nuclear para una eficiente translocación del RN a núcleo donde ejerce su acción regulando la expresión de genes blanco. Si bien los gluco y los mineralocorticoides juegan un rol importante en la adipogenesis, nada se sabe acerca del rol de las IMMs durante la adipogénesis y menos aún en su posible rol regulatorio de factores de transcripción que no pertenezcan a la familia de los receptores nucleares, temas que nos encontramos investigando.

Publicaciones Internacionales

Desde 1998 hasta la fecha
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Laboratorios
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