Bioquímica Neuroendócrina

Probable transferencia de los resultados: Las investigaciones que realiza el Laboratorio de Bioquimica Neuroendócrina sobre el papel de la progesterona en modelos animales de esclerosis lateral amiotrófica (ELA), de esclerosis múltiple (MS) y en lesiones de la médula espinal permitirán extrapolar sus resultados a las afecciones clinicas que representan estos modelos. El laboratorio también estudia el papel neuroprotector de los estrógenos en las encefalopatias de la hipertensión arterial y diabetes mellitus, y el rol neurotóxico que jugarían los mineralocorticoides en estas mismas afecciones. El objetivo es posibilitar nuevas estrategias terapéuticas basadas en esteroides neuroactivos para las patologías del sistema nervioso central.

 

A translational approach of our experimental results: Present investigations of the Laboratory of Neuroendocrine Biochemistry have disclosed the beneficial role of progesterone in animal models of amyotrophic lateral sclerosis (ALS), multiple sclerosis (MS) and spinal cord injury. Our objectives will allow the extrapolation of experimental results to clinical conditions representing these models. The laboratory has also studied the neuroprotective role of estrogen in the encephalopathy of hypertension and diabetes mellitus, and the neurotoxic role that mineralocorticoids would play in the same conditions. Our aim is to develop new therapeutic strategies based on neuroactive steroids to find a cure for pathologies of the central nervous system.


Bioquímica Neuroendócrina

  • Director

    Prof. Dr. Alejandro F. De Nicola Currículum Vitae

    Investigador Superior del CONICET

    Profesor Emérito de la Universidad Nacional de Buenos Aires

    Médico (1961), Doctor en Medicina (1971).

  • Integrantes

     

    Dra. Maria Claudia Gonzalez Deniselle

    Dra. Florencia Labombarda

    Bioq. Laura Garay

    Dra. Luciana Pietranera

    Sra. Analia Lima

    Srta. Paulina Roig

    Dra. Maria Meyer

    Médica Gisella Mariana Gargiulo Monachelli

    Sr. Ignacio Jure

    Bioq. María Elvira Brocca

    Intersheep Eline Willemsee

     

Publicaciones Internacionales

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Línea de investigación

a) Investigaciones sobre el papel de la progesterona (PROG) en un modelo animal de esclerosis lateral amiotrófica (ELA)

La PROG ejerce efectos neuroprotectores en la injuria y degeneración del sistema nervioso central y periférico. La similitud en las acciones del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y PROG sugieren que la neurotrofina podria estar involucrada en la neuroprotección hormonal. En esta línea observamos que la expresión del ARNm para BDNF y la inmunomarcación y la actividad de colina acetiltransferasa (ChAT) estaban francamente disminuídas en motoneuronas del Wobbler, mientras que el tratamiento con PROG durante 60 dias revirtió estos parámetros a limites normales Asimismo, la sobrevida, la sintomatología clinica, el peso del bíceps y la fuerza muscular se estimularon por PROG. Sugerimos que el BDNF es un intermediario de las acciones neuroprotectoras de PROG en este modelo de neurodegeneración.

b ) Investigaciones sobre el papel de PROG en el trauma de la médula espinal.

El trauma de la medula espinal conduce a cambios en todos los tipos celulares, tales como cromatólisis neuronal, hiperreactividad astrocitaria, desmielinización de oligodendrocitos, proliferación de precursores oligodendrocitarios y disminución de la expresión del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y del fenotipo colinérgico. El tratamiento con PROG previene los cambios neuronales y estimula la expresión de BDNF, de la enzima sintetizadora de acetilcolina y del ARNm y proteina de la MBP. En conjunto, evidenciamos que la PROG ejerce importantes propiedades mielinizantes y neuroprotectoras en el ambiente permisivo brindado por la injuria de la medula espinal.

c) Neuroprotección por PROG en un modelo murino de esclerosis múltiple.

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo de Esclerosis Múltiple (MS) inducida en ratones C57/BL6 por inmunización con la glicoproteína oligodendrocitaria de mielina MOG 40-54 . Los animales presentan parálisis, trastornos motores, zonas desmielinizadas con falta de tinción al Lugol Fast Blue, disminución de la inmunomarcación para la proteina básica de mielina, proteolipido proteina (PLP) y del ARNm para PLP. El tratamiento previo con PROG retardó la aparición de la enfermedad, mejoró los síntomas clinicos y aumentó la mielinización en los tractos corticoespinal y funiculo anterior de la medula espinal. Estos efectos sugieren a la PROG como un tratamiento farmacológico novel para la MS.

d) Regulación de la proliferación neuronal en modelos de diabetes mellitus tipo I y ratones en proceso de envejecimiento.

La neurogénesis -proliferación de nuevas neuronas- del hipocampo está afectada en ratones con diabetes tipo I (T1D) y en ratones en la etapa media de su vida (10-12 meses). Esta alteración se inscribe dentro de otras que afectan distintas estructuras cerebrales y en especial el hipocampo ligadas a la diabetes y envejecimiento. Numerosos estudios muestran que la prevalencia de la depresión es muy alta en T1D y por otro lado, la reducción de la neurogénesis es característica de ciertas depresiones. En primer lugar, observamos que el antidepresivo fluoxetina (FXT) aumentaba la proliferación celular y modulaba la diferenciación y migración de nuevas neuronas granulares en la T1D. Efectos similares se observaron luego del tratamiento con estradiol tanto de animales diabéticos como animales en la etapa media de su vida. Ambos grupos presentaron en ausencia de tratamiento astrocitosis y disminución del número de neuronas del hilio, siendo estos parámetros revertidos por estradiol. Los datos sugieren que los estrógenos y antidepresivos poseen efectos comunes en el hipocampo ya que podrian desactivar la sobreestimulación del eje HPA y de la secreción del glucocorticoides, factores que aumentan la vulnerabilidad hipocámpica.

e) Anormalidades del hipocampo y su reversión por estrógenos en ratas espontáneamente hipertensas y ratas DOCA-sal.

En esta linea de investigación encontramos en dos modelos de hipertensión arterial, ratas SHR y ratas tratada con DOCA-sal, disminución de la proliferación celular en el giro dentado (DG) del hipocampo, hiperreactividad astrocitaria GFAP positiva, y pérdida neuronal en el hilio del GD. El tratamiento de ambos modelos de hipertensión arterial con 17 b estradiol, un esteroide neuroprotector y antioxidante, aumentó la proliferación celular en el GD y el número de neuronas del hilio, al tiempo que atenuó la astrocitosis. Sugerimos que los parámetros mencionados están sujetos a un doble control: en parte tóxico debido al "overdrive" glucocorticoide o mineralocorticoide manifiesto en SHR y ratas DOCA-sal, y en parte reparador debido a los estrógenos. En ambos casos, la vasculopatia - e isquemia cerebral - proveen un ambiente permisivo esencial para evidenciar la protección y toxicidad inherentes a los diferentes tipos de hormonas esteroides.

 

La progesterona COMO ESTRATEGIA TERAPEUTICA PARA  enfermedades del sistema nervioso centraL

 

            Los estudios clásicos consideraron a la progesterona como una hormona relacionada con la ovulación, preñez y comportamiento sexual. Sin embargo, ya en 1941 Hans Selye había demostrado que poseía propiedades anestésicas, mientras finalmente Baulieu y colaboradores (2001) describieron que además de actuar como un esteroide neuroactivo, se producia localmente en el sistema nervioso, acuñando el término “neuroesteroide”. Nuestras investigaciones se centran sobre las acciones mielinizantes y neuroprotectoras de la progesterona luego de la injuria del sistema nervioso central, en la neurodegeneración y en neuroinflamación..

            Como resultado de una lesión de la médula espinal producida en la rata, las motoneuronas del asta ventral degeneran por un proceso denominado cromatólisis, por el cual la sustancia de Nissl (ribonucleoproteínas) se agolpa en la membrana plasmática dándole un aspecto atigrado a la neurona.. La cromatólisis, que es un proceso reversible al contrario de la apoptosis,  cursa con disminución de la expresión de moléculas fundamentales para el funcionamiento neuronal, incluyendo factores neurotróficos, enzimas de la neurotransmisión y la bomba de sodio que mantienen el potencial de membrana. Asimismo, se descontrola la actividad  de la glia  (astrocitos, microglia ) y de los progenitores de oligodendrocitos (OPC). La lesión medular produce desmielinización con disminución de las proteinas centrales de la mielina y de los factores de transcripcion de la mielina central, mientras que los OPC  proliferantes no se diferencian a oligodendrocitos maduros productores de mielina. Los astrocitos y microglia reactivos  produced sustancias proinflamatorias y tóxicas para las neuronas, acentuando la desmielinización y neurodegeneración. 

            Es altamente auspicioso comprobar que la administración in vivo de progesterona a ratas por períodos entre 3 a 21 dias revierte las anormalidades debidas a la lesión de la médula espinal. Por ejemplo, disminuye la cromatólisis neuronal, estimula la proliferación de los OPC e induce su diferenciación y maduración para sintetizar mielina.  El tratamiento agudo con progesterona inhibe la proliferación de astrocitos y microglía, mientras que su continuación por 21 dias inhibe la activación de estos tipos gliales.. En conclusión, la administración de progesterona  luego del trauma de la medula espinal  inhibe la astrogliosis y microgliosis, ejerce efectos antiinflamatorios por inhibición de la microglia y de las citoquinas proinflamatorias, favorece la remielinización a partir de la proliferación de OPC y su diferenciación a celulas capaces de generar mielina; y  previene la degeneración neuronal. Por consiguiente, la progesterona constituye un arma terapéutica importante para las lesiones de la médula espinal. 

            Las acciones anti-inflamatorias e inmunomodulatorias de la progesterone se han explorado con profundidad en modelos animales de enfermedades autoinmunes. Estos estudios se basaron en conocidas observaciónes clinicas en  mujeres embarazadas que padecían de esclerosis múltiple (EM). La EM es una enfermedad autoinmune que ataca la mielina, y en mujeres embarazadas los relapsos de la enfermedad remiten en el 3º trimestre, debido a los altos niveles de esteroides sexuales circulantes. Para explicar este hallazgo clinico, se ha empleado un modelo experimental denominado encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), por el cual ratones son inmunizados con un péptido de la mielina llamado MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein). Estos ratones desarrollan signos clinicos tales como pérdida de la tonicidad de la cola, espasticidad, parálisis de miembros posteriores, etc.   A nivel neuroquimico, la médula espinal  sufre de infiltración linfocitaria y macrofágica, desmielinzación en focos con disminución de las proteinas centrales de la mielina : MBP (proteina básica de la mielina) y PLP (proteolipido proteina)., se desarrolla astrogliosis y aparecen lesiones y pérdida de axones además de cambios degenerativos de las neuronas.  El pretratamiento con progesterona de estos animales produjo resultados espectaculares, tales como el retardo en la aparición de la enfermedad y la atenuación del grado clinico. A nivel de la médula espinal, la progesterona produjo marcado descenso de la desmielinización, demostrada por la mayor expresión de MBP y PLP, menor infiltración macrófagica y de celulas del sistema inmune,  y disminución de la astrogliosis.. Asimismo, la progesterona ejerce poderosos efectos antiinflamatorios locales, disminuyendo la expresión de los ARN mensajeros del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), interleuquina 1b y del marcador de microglia C11b determinados por reacción de la polimerasa en tiempo real. En la EAE, los efectos de la progesterona incluyen: neuroprotección y promielinización de la médula espinal, además de  suprimir la respuesta inmune. Teniendo en cuenta que los efectos de progesterona podrían ser sistémicos por supresión del sistema inmune periférico, se realizaron nuevos estudios empleando un modelo focal de desmielinización por inyección intraespinal de la gliotoxina lisolecitina. Los resultados fueron similares a los obtenidos con el modelo EAE, lo que sugiere que las acciones de la progesterona son en parte independientes del sistema inmune sistémico. Los datos resultan importantes por su  aplicación la clinica.. En este sentido, un estudio multicéntrico europeo (POPART-MUS) emplea actualmente la progesterona, en agregado a estrógenos,  para prevenir los relapsos post-parto de mujeres con EM.

 

            En agregado a los ejemplos mencionados anteriormente, el rol protector de la progesterona se extiende también a un modelo de neurodegeneración de motoneurona y a humanos que padecen de esclerosis lateral amiotrófica (ELA).   La ELA es una enfermedad crónica que afecta las motoneuronas espinales y bulbares, siendo la sobrevida inferior a 5 años. Existen varios modelos de ELA, uno de ellos es  el ratón Wobbler, que presenta una mutación de la proteina de tráfico intracelular Vps54. En las motoneuronas espinales, se observa degeneración no apoptótica, con extensa vacuolización debida al aumento del estrés oxidativo.  La expresión de moléculas tales como el factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF) se encuentra disminuída en Wobblers en estadio clínico sintomático, mientras que la progesterona corrige esta deficiencia. Estudios posteriores se desarrollaron en ratones Wobblers genotipificados wr/wr de 3 estadios: progresivo temprano (1-2 meses), establecido (5-8 meses) y tardio (12 meses) y controles NFR/NFR de edades similares. La mitad de cada grupo recibió progesterona por 3 semanas. Los estudios inciales evaluaron la vacuolización de motoneuronas, la expresión del ARNm para BDNF, y parámetros gliales tales como la densidad de astrocitos, la expresión de la enzima detoxificante del glutamato -glutamina sintetasa-  y el número de oligodendrocitos  en los diversos estadíos evolutivos de la enfermedad. El tratamiento con progesterona de Wobblers disminuyó la degeneración vacuolar en todos los estadios, elevó la expresión del BDNF en los estadios establecido y tardio, disminuyo la astrogliosis y aumentó la densidad de oligodendrocitos maduros y de celulas que expresaban glutamina sintetasa (Meyer y col., 2010). Funcionalmente, el tratamiento prolongado con progesterona mejoró la fuerza muscular y la sobrevida de los Wobblers.  Los resultados han sido extrapolados en cierta medida a humanos con ELA. Esta enfermedad  es habitualmente tratada con riluzole, un fármaco antiglutamatérgico. Dados los datos que demostraban  las acciones neuroprotectora de progesterona en el Wobbler, se evaluó la utilidad de la misma en pacientes con ELA. El dosaje de esteroides en sangre demostró que la sobrevida se asociaba positivamente a los niveles mas elevados de progesterona, al contrario de lo que ocurría con el cortisol plasmático. Asimismo, en forma preliminar se ha podido demostramos que la terapia combinada con riluzole  + progesterona mostró una tendencia a prolongar la sobrevida con baja probabilidad de efectos adversos .   

            Finalmente, es preciso mencionar que los efectos descritos en los distintos modelos experimentales pueden originarse en mecanismos genómicos, a través del receptor nuclear clásico para progesterona (PR) que actúa como un factor regulador de la transcripción de genes blanco. Existen dos isoformas de PR, llamadas PRA y PRB. Asimismo, existe la posibilidad de efectos no genómicos, a través de receptores de membrana alternativos (mPR) de los cuales se han descrito 3 variedades: a, b y g acoplados a proteina G, y un cuarto receptor de membrana denominado 25 DX, fuertemente expresado en el asta dorsal de la medula espinal. Para complicar mas el panorama, la progesterona puede reducirse a dos metabolitos, uno con capacidad de unión al RP, la 5-dihidroprogesterona, y otro que actúa como agonista del receptor GABAa, la tetrahidroprogesterona (alopregnanolona). Ambos ejercen acciones neuroprotectoras. Como puede apreciarse, son múltiples los mecanismos e intermediarios de la acción de este esteroide pleiotrópico, la progesterona a nivel de la médula espinal y nervios periféricos. 

           

EL ESTRADIOL COMO ESTRATEGIA TERAPEUTICA PARA LA ENCEFALOPATIA ASOCIADA A LA HIPERTENSION arteriaL Y DIABETES.

           

            De manera similar a lo expresado para la progesterona, los trabajos iniciales que señalaban a los estrógenos como las hormonas típicas que regulaban los fenómenos reproductivos, fueron seguidos por una avalancha de evidencias sobre el rol fundamental que juegan los estrógenos para la neuroprotección. Desde tiempos inmemoriales, se asociaron los estrógenos a la terapia de reemplazo hormonal del climaterio. Sin embargo, hoy dia se re-evalúa el papel de los estrógenos en sus diversas formas, ya sean naturales como sintéticos y a los reguladores selectivos del receptor estrogénico (SERM), como los agentes de elección para el tratamiento del cerebro senil y sus patologías asociadas. La hipótesis de la protección cerebral por los estrógenos se ha extendido a varias enfermedades neurodegenerativas y síndrome psiquiatrico.

            Los estrógenos actúan de diversas maneras en el sistema nervioso. Existen dos subtipos de receptores estrogénicos clásicos, denominados ERalfa y ERbeta, producto de dos genes diferentes, aunque con similitud aminoacídica en los diferentes dominios. ERb y ERa muestran una distribución diferente en el sistema nervioso. Por ejemplo, ERa se expresa  mayormente en el núcleo arcuato y ventromediano del hipotálamo, mientras que el ERb se concentra en el hipocampo, núcleos paraventricular y ventromediano del hipotálamo y en el area preóptica. Se han descrito receptores de membrana que unen estrógenos, tales como el receptor unido a proteina G (GCR30) que está acoplado a la activación rápida de la proteina quinasa activada por mitógenos (MAPK/ERK), el ERX especifico para el 17 a estradiol, y la interacción proteina/proteina entre el ERa y el receptor para el factor de crecimiento insulina-simil (Garcia-Segura y col., 2001). La intervención  de uno o varios de estos mecanismos llevaa al control, a nivel cellular, de la neurogénesis, prevención de la muerte neuronal, aumento de la supervivencia neuronal y crecimiento de neuritas, prevenciónde la excitotoxicidad glutamatérgica, la estimulación de la sinaptogénesis y a los efectos antioxidantes y anti-inflamatorios..

                       

            Un tema de gran actualidad es el empleo de la neuroprotección estrogénica para las enfermedades neurodegenerativas que aparecen durante el envejecimiento, entra las que se halla la encefalopatía de la hipertensión arterial.  La hipertensión arterial en el humano es causante no solamente de accidentes cerebrovaculares, sino también se asocia a una importante encefalopatia, que afecta al hipocampo. El hipocampo es una región cerebral importante para la memoria de corta duración , aprendizaje y la génesis de nuevas neuronas en el cerebro adulto. Un modelo de elección es la rata espontáneamente hipertensa (SHR) de causa poligénica, cuya encefalopatía cursa con atrofia cerebral y del hipocampo, hidrocefalia  y pérdida de sustancia blanca. Asimismo, las SHR  presentan disminución de la génesis de nuevas neuronas en el giro dentado, proliferación de astrocitos y pérdida neuronal en el hilio del giro dentado del hipocampo. Estos cambios revierten luego del tratamiento con estradiol administrado in vivo . Como se sabe que el cerebro fabrica sus propios “neuroesteroides” luego del descubrimiento de Baulieu, también investigamos la expresión de aromatasa, enzima responsable de la síntesis endógena (local) de estradiol, pensando que la síntesis de estrógenos endógenos podria estar defectuosa en las ratas SHR. Se sabía que la enzima aromatasa se expresa en el sistema nervioso particularmente en el hipocampo, está involucrada en la regulación de la plasticidad neuronal, se le reconoce un efecto neuroprotector y su expresión aumenta en respuesta a la injuria. Lo que resultó una verdadera sorpresa, fue la observación que la expresión del gen de la aromatasa determinada por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, y la determinación de la proteina por inmunohistoquimica, estaba aumentada en los animales SHR. Lo interesante fue comprobar que las SHR mostraban un aumento posterior de la aromatasa cuando se trataban con estradiol.  Concluimos que los estrógenos exógenos y los localmente producidos por la aromatasa actuarían en conjunto ejerciendo efectos neuroprotectores sobre la encefalopatía hipertensiva, aumentando la génesis de nuevas neuronas necesarias para incorporar nuevas memorias y aprendizajes, y para el correcto funcionamiento neuroendócrino del hipocampo.   

 

            En forma similar a la hipertensión arterial , la diabetes mellitus afecta múltiples sistemas entre los que se encuentra el sistema nervioso central, siendo el hipocampo una de las estructuras más vulnerables. En forma semejante a lo descrito para los mineralocorticoides en ratas SHR, los glucocorticoides resultaron ser esteroides moduladores negativos (neurotóxicos) para la proliferación celular en el giro dentado del hipocampo. Esto se debía a que la corticosterona plasmática resultó elevada, el ritmo circadiano estaba ausente y la respuesta de la adrenal a la ACTH in vitro se encontraba aumentada, convirtiendo a la sobreactivación del sistema glucocorticoide en un factor responsable de la encefalopatía de la diabetes mellitus. Esta hipótesis se comprobó mediante la administración del antagonista del receptor para glucocorticoides (GR) conocido como RU486 o Mifepristone.  Se determinó la proliferación celular en el giro dentado mediante inmunomarcación para Ki67 y se encontró una disminución en los animales diabéticos y una recuperación por el tratamiento con RU486. La diferenciación de las nuevas células hacia neuronas se estudió por inmunofluorescencia para bromodesoxiuridina  y microscopía confocal. En los animales diabéticos se encontró una menor diferenciación y el RU486 logró una reversión hacia valores controles, lo cual apoyaba  el papel neurotóxico de los glucocorticoides sobre la neurogénesis hipocampal.  El sistema, sin embargo, resultó ser altamente plastico y con capacidad de recuperación por tratamiento estrogénico. Mediante el tratamiento con estradiol por un plazo de 10 dias, se revertió completamente la reducción de la proliferación celular del ratón diabético. Al mismo, tiempo, las neuronas del hilio del giro dentado volvieron a valores normales, asi como la densidad de los astrocitos volvió a niveles controles. Fue interesante constatar que la administración de estrógenos no alteró el estado hiperglicémico de los animales ni tampoco la tasa proliferativa neuronal en los controles. Por consiguiente, comprobamos el valor de los estrógenos como una herramienta adicional para el tratamiento de los trastornos cerebrales de la diabetes mellitus.  Podemos concluir que la maquinaria celular puesta en marcha durante la protección estrogénica en las enfermedades asociadas al envejecimiento es intrinsicamente compleja y podría mostrar distintas modalidades dependientes de la patología pre-existente. A nivel celular, sin embargo, son varias las funciones deficitarias en el envejecimiento, hipertensión arterial y diabetes mellitus cuyo denominador común es la respuesta positiva a los esteroides neuroactivos con estructura estrogénica.. 

 

 

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